Новости науки, псилоцибин Опции

[shroomy]

Ученые разобрались в том, почему активное вещество галлюциногенных грибов — псилоцибин — в малых дозах облегчает стирание травматических воспоминаний. Также в малых дозах он способствует образованию новых нейронов в мозге.

Активный ингредиент галлюциногенных грибов – псилоцибин — помогает стирать память о страхе и боли, а также при небольших дозах стимулирует образование новых нейронов в мозге – нейрогенез. Об открытии сообщает команда исследователей из Университета Южной Флориды в журнале Experimental Brain Research.

При экспериментах с мышами ученые обнаружили, что под действием псилоцибина мыши быстрее забывали негативный опыт — удар электрическим током.

У мышей в экспериментальной камере вырабатывали условный рефлекс. Животные слышали резкий звук, за которым следовал удар током через решетчатый пол камеры. После многократного повторения в ответ на звук мыши замирали, демонстрируя страх. После выработки и закрепления условного рефлекса мышей снова помещали в камеру и включали звук, но током при этом не били. Постепенно память о перенесенном страхе у них угасала.

Выяснилось, что у тех животных, которым перед опытом вводили псилоцибин, эта негативная память угасла быстрее, чем у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор. «Они прекращали замирать, забывали свой страх», — объясняет профессор Хуан Санчес-Рамос, соавтор исследования. Причем псилоцибин оказал такой эффект при незначительной дозе, намного меньше той, которая вызывает психоактивные эффекты. Хотя, как заметил исследователь, «мышь не может сказать, что она чувствует — возникают ли у нее галлюцинации или измененное состояние сознания».

Псилоцибин впервые изолировали из грибов Psilocybe Mexicana, растущих в Центральной Америке. Это психоделик, обладающий галлюциногенными свойствами. Его пытались применять и в медицине для лечения депрессий и посттравматического синдрома, хотя в большинстве стран псилоцибин находится под запретом.

Психоактивное действие псилоцибин оказывает через взаимодействие с рецепторами серотонина, тем самым он изменяет действие этого нейромедиатора.

Биологи решили экспериментально проверить действие псилоцибина на формирование памяти. Еще было интересно изучить его влияние на образование нервных клеток в мозге – нейрогенез. Вопреки расхожему мнению, что «нервные клетки не восстанавливаются», в некоторых зонах мозга в течение всей жизни образуются новые нейроны из нейрональных стволовых клеток. К числу таких зон относится и гиппокамп. А уже было известно, что в нейрогенез вовлечены именно те серотониновые рецепторы, на которые действует псилоцибин.

Для изучения нейрогенеза в мозге мышей ученые применили стандартный прием – введение вещества, которое накапливается в делящихся клетках. После того как из мозга мышей изготовили тонкие срезы, специальная окраска пометила вновь образовавшиеся нейроны.

Интересно, что в высоких дозах псилоцибин негативно действует на нейрогенез. Но в малых дозах, показали ученые, он, скорее, его стимулирует.

Таким образом выяснилось, что псилоцибин в малых дозах способствует угасанию негативной памяти у мышей. Вероятно, так же он действует и на пациентов с посттравматическим стрессовым расстройством, и на депрессивных больных. Вместе с тем псилоцибин стимулирует нейрогенез. Биологи предполагают, что одно связано с другим. И эти свойства можно использовать «в мирных целях», если пытаться избавить больных от травмирующих воспоминаний или от депрессии. Но – и это очень важно – галлюциноген действует так только в малых дозах! Поэтому не стоит бежать в лес за поганками.

[shroomy]

Экспертное исследование плодовых тел грибов, содержащих псилоцин и псилоцибин. Методические рекомендации

Законодательство России
Текст документа по состоянию на июль 2011 года
Утверждены
Постоянным комитетом
по контролю наркотиков
15 июня 2005 года
(протокол N 3/99-2005)


Утверждены Постоянным комитетом по контролю наркотиков (протокол N 3/99-2005 от 15 июня 2005 г.).
Одобрены и рекомендованы к публикации методическим советом ЭКЦ МВД России.


В настоящее время широкое распространение в незаконном обороте наркотиков в России получили плодовые тела грибов, содержащие псилоцин и псилоцибин. Наиболее часты случаи изъятия этих грибов в северных областях: Новгородской, Псковской, Смоленской, Тверской, Кировской, Ленинградской. Данный наркотик обладает галлюциногенным действием и употребляется перорально.
Предлагаемая работа представляет собой комплексную методику исследования плодовых тел грибов, содержащих псилоцин и псилоцибин, включающую их морфологическое исследование, а также химическое исследование с использованием методов тонкослойной, газовой, жидкостной хроматографии, хроматомасс-спектрометрии, метода капельных цветных реакций.


ДАННЫЕ ОБ ОБЪЕКТЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Плодовые тела грибов, содержащие псилоцин и псилоцибин, относятся к наркотическим средствам растительного происхождения и стали изыматься из незаконного оборота на территории России сравнительно недавно, не более 10 лет назад.
Как известно, грибы - это нефотосинтезирующие организмы с хорошо выраженной клеточной стенкой, важнейшим компонентом которой является хитин. Для грибов характерны: гетеротрофный способ питания путем всасывания, неподвижность в вегетативном состоянии, неограниченный рост и наличие в качестве запасного вещества гликогена. Основой вегетативного тела гриба является мицелий, или грибница, представляющая собой систему микроскопически тонких ветвящихся нитей (гиф) с апикальным ростом и боковым ветвлением. Среди грибов встречаются одноклеточные формы, но большинство имеет нитевидное тело, а структуры, подобные шляпочным грибам (плодовые тела), состоят из множества гиф (плотно упакованных нитей). В настоящее время описано около 120000 видов грибов.
В процессе жизнедеятельности в грибах образуются физиологически активные вещества - антибиотики, витамины, органические кислоты, ферменты. Кроме того, грибы могут содержать токсины (ядовитые соединения), такие как монометилгидразин, орелланин, кортинарин, коприн, мускарин, буфотенин, иботеновую кислоту и т.д., при употреблении вызывающие различные функциональные нарушения (расстройства, отравления) в организме человека. Среди них можно выделить токсины с нейротропным действием, т.е. вызывающие нарушение деятельности центральной нервной системы (симптомы - приступы смеха, плача, галлюцинации).
Грибы, содержащие вещества галлюциногенного действия, являются частью культуры многих народов и использовались уже более 3 тыс. лет назад. Об этом свидетельствуют археологические находки в горных районах и на тихоокеанском побережье Гватемалы и Сальвадора, связанные с культурой древних майя, такие как фигурки в виде каменных грибов, украшенных лицами богов и демонов, грибные статуэтки, обнаруженные при раскопках храмов и могильников, а также присутствие этого мотива в каменных и глиняных изделиях. Эти находки относят к 1650 - 1050 гг. до н.э. Археологи полагают, что галлюциногенные грибы оказывали влияние на религию древних майя, особенно в сфере гаданий и целительства (наряду с ядом жаб и водяной лилией Nymphaea amplea), а также служили предметом торговли для этой древней культуры.
Галлюциногенные грибы, представители родов Stropharia и Psilocybe, были неотъемлемой частью ритуалов ацтеков. Во время коронации Монтесумы, чтобы внушить подданным идею его божественного происхождения, к столу подавались "волшебные" грибы, считавшиеся священными до такой степени, что получили название Теонанакатл (Teonanacatl), что означает "плоть богов", "божественный гриб". Кроме того, Монтесума устраивал раз в год "праздники откровений", когда приглашенные сановники и сам Монтесума ели волшебные грибы. Летописец Тесосомок указывал на высокую стоимость этих грибов и о необходимости "не спать ночами, чтобы найти их". Индейцы считали, что гриб разговаривает с человеком и открывает ему тайны мироздания. Жрец, употребляя этот гриб, общался с духами, предсказывал будущее, исцелял людей. Интересен тот факт, что для исцеления человека от болезни жрец может давать снадобье больному, а может употреблять его сам. Найденная в Центральной Америке статуя Хохшипилли (XVI в.) изображает Принца Цветов, украшенного "волшебными" растениями (табак, орхидея, т.д.) и грибами.
Первые письменные упоминания об использовании грибов с галлюциногенной активностью в религиозных целях обнаружены в описаниях испанских хронистов и натуралистов, попавших в Мексику в XVI веке. Одним из первых авторов является францисканский монах Бернардино де Шахагун, автор труда под названием "Общая история новой Испании" (1560 г.). В различных своих работах он указывал на активное применение грибов, подробно описал ритуал употребления, эффекты приема галлюциногенов и их использование в различных целях не только жрецами, но и простыми ацтеками. Прибывшие в Новый Свет католические миссионеры подвергли ритуалы и церемонии ацтеков гонениям, убивая всякого, кто был застигнут во время этих ритуалов. Использование грибов в Мексике было запрещено (1521 г.). По этой причине культовые обряды, связанные с грибами, сохранялись в глубокой тайне только в самых отдаленных от цивилизации уголках Мексики. При столкновении двух верований появилась своеобразная смесь христианства и грибных ритуалов. В сегодняшних верованиях индейцев переплетены как древние доколумбовые, так и христианские традиции. В современной интерпретации с шаманом (жрецом) разговаривают не духи, а сам Христос. Примером тому служит Мария Сабина, шаманка, обнаруженная одной из исследовательских групп в середине прошлого века (R. Gordon Wasson). В ее грибных ритуалах использовались католические атрибуты - алтарь Иисуса Христа, лик Девы Марии и т.п., а в грибных откровениях она общалась непосредственно с Христом. Информация о Марии Сабине и используемых ею грибах была опубликована в мае 1957 года в США (R.G. Wasson "Поиски Волшебного Гриба" - "Seeking the Magic Mushroom").
Жители горного региона Новой Гвинеи - народности кума и каимби употребляли грибы Pandanus, Boletus и Psilocybe, вызывающие озноб, галлюцинации, потерю речи и раздвоение зрительных образов. Среди записей миссионеров, которые проповедовали в этих местах в начале XX в., есть упоминание об употреблении туземцами дикого гриба с местным названием "нонда" для достижения состояния бешенства: "нонду ели перед тем, как идти убивать человека или в периоды возбуждения, гнева или скорби". Некоторые антропологи утверждают, что поведение и поступки, совершенные под действием грибов у этих племен, являются узаконенной формой проявления склонностей, на которые наложен запрет в обыденной жизни (например, настоящая агрессия против своих соплеменников). В отличие от других обществ, где основной целью является установление контакта со сверхъестественным, употребление галлюциногенных грибов в Новой Гвинее связано с внутриплеменными отношениями.
Ритуальное использование псилоцибиновых грибов имеет исторические примеры и в европейских культурах. В древней Греции недалеко от Афин проводились ритуалы, вошедшие в историю, как мистерии Элевсиса. Исследователи полагают, что таинство происходило в храме Деметры, богини земледелия, в Зале Посвящений, Телестерионе. Во время ритуалов подавался напиток, который был изготовлен из грибов, вызывающий необычные видения. Все происходившее во время церемоний держалось в строжайшем секрете - всякому, поведавшему его непосвященным, грозила смерть. Эти ритуалы продолжались до их подавления во время раннего христианства.
В 1977 г. во время конференции, посвященной грибам, ученые R.G. Wasson и A. Hofmann высказали гипотезу, что мистерии Элевсиса строились вокруг псилоцибиновых грибов. Позже они опубликовали свои работы в книге "Путь в Элевсис: тайны мистерий", где описано, что в мистерии участвовали также Аристотель и Платон.
Возникновение города Микены также связывают с видением, которое пережил его основатель после употребления галлюциногенных грибов (от греч. mykos - гриб).
В средневековой Европе грибы долгое время считались колдовским, дьявольским творением или орудием ведьм (отсюда народные названия "ведьмино яйцо", "сатанинский гриб", выражение "ведьмин круг"), а в первой иллюстрированной книге, посвященной травам (1560 г.), грибы изображены вместе с извивающимися змеями.
В древней Скандинавии существовали специальные отряды воинов - берсеркеров, которые перед боем съедали кусочки мухомора или выпивали напиток из него и впадали под действием содержащихся в нем токсинов в состояние бешеной ярости, "не чувствовали ран и ударов оружия, шли, сметая все на своем пути".
Информации об употреблении галлюциногенных грибов на территории России практически нет (присутствие мотивов в фольклоре, архитектуре, надгробиях староверов), и сводится в основном к употреблению мухоморов (Amanita muskaria) коренными жителями Сибири (чукчи, эвенки, а также коряки, камчадалы, юкагиры). Amanita muskaria, в отличие от других галлюциногенов, вызывает неестественную сильную физическую подвижность.
Подобные исторические факты и наблюдения не могли не заинтересовать ученых. Так, американские антропологи в 1930-х гг. посетили ритуальные церемонии, где наблюдали употребление галлюциногенных грибов (Гуаутл де Джименз, штат Оахаса, Мексика). В 1938 г. американский ботаник Richard Е. Schultes собрал экземпляры этих грибов (род Psilocybe), которые заняли место в гербарии Гарварда. В 1950-х гг. французский профессор микологии Roger Heim провел идентификацию гриба teonanacatl: галлюциногенные грибы впервые были подробно описаны и классифицированы (принадлежность к роду Psilocybe, кроме того, ему удалось искусственно вырастить во Франции культуру гриба Psilocybe mexicana). В это же время американский исследователь R. Gordon Wasson впервые принял участие в грибных ритуалах.
В 1958 г. швейцарский химик A. Hofmann выделил вещество из грибов Psilocybe mexicana, названное псилоцибином, установил его формулу и способы синтеза. Несколько лет коммерческий псилоцибин выпускался швейцарской фармакологической компанией Sandoz для исследовательских лабораторий.
В 1960-х гг. история исследования галлюциногенных грибов тесно связана с профессором Гарвардского университета Thimothy Leary и его единомышленниками, которые исследовали действие галлюциногенных грибов на себе и провели ряд крупных экспериментов ("Good Friday" - участвовали 20 студентов Бостонского университета; "Конкордский проект" - использование псилоцибина среди заключенных тюрьмы Конкорд с целью более успешной социальной реабилитации). В 1963 г. Т. Leary был уволен из Гарварда за продолжающиеся эксперименты с психоделиками с привлечением студентов, но его теории и идеи становятся очень популярными среди молодежи. К сожалению, поздние работы Т. Leary, где он утверждает, что наркотики - не подходящее занятие для молодежи, которой не хватает жизненного опыта и необходимых знаний в области медицины, психологии и философии для правильного восприятия и осмысления происходящего, не нашли такой популярности, как ранний этап его исследовательской деятельности в области использования наркотиков.
Наиболее известными среди галлюциногенных грибов считаются представители рода Psilocybe (из более чем 140 видов грибов указанного рода в 80 из них содержатся психоактивные вещества). Виды грибов этого рода являются космополитами и широко распространены почти по всем континентам. Данные грибы являются сапрофитами, селятся на почве, отмерших ветвях и стеблях растений, встречаются на опилках, торфе, навозе; обитают на сфагновых болотах, встречаются в лесах, парках, на пастбищах, по окраинам дорог. Характерная черта многих грибов - обитание на заболоченной почве. Наиболее часто в качестве наркотиков используются Psilocybe semilanceata и Psilocybe cubensis. Кроме того, псилоцибин обнаружен в грибах следующих родов: Panaeolus (Coprinaceae), hiocybe (Cortinariaceae), Conocybe (Bolbitiaceae), Pluteus (Pluteaceae). Всего насчитывается более 100 видов грибов, содержащих псилоцибин и псилоцин.
Грибы, обладающие галлюциногенным действием и произрастающие в наших широтах, можно разделить на две группы:
1. Грибы, содержащие в качестве активного вещества иботеновую кислоту, мускимол, мусказон и мускарин. К этой группе относятся Amanita muscaria, A. pantherina, A. phalloides, A. vema, A. virosa.
2. Грибы, содержащие псилоцибин, псилоцин и баеоцистин. Содержание псилоцибина и баеоцистина в грибах разных видов и даже одного вида сильно варьирует и равно 0,1 - 2,4% и 0,05 - 0,7% соответственно. Содержание может изменяться под действием света, повышенной температуры и других факторов (например, содержание алкалоидов в Psilocybe coprophilia резко уменьшается после сбора). Кроме того, по литературным данным, наибольшая концентрация псилоцибина определялась в молодых грибах.
На территории России обнаружено 3 вида псилоцибиносодержащих грибов: Psilocybe semilanceata (ареал распространения Ленинградская, Псковская, Пензенская обл., Дальний Восток), Inocybe corydalina (Ленинградская, Пензенская обл., Центральная и Южная Россия, Восточная Сибирь, Дальний Восток) и Panaeolus subbalteatus (Центральная Россия, Сибирь). Содержащие псилоцибин грибы могут быть собраны в местах их естественного произрастания, а также искусственно культивированы на специальных средах.
В настоящее время к наркотическим средствам отнесены псилоцин и псилоцибин, а также плодовые тела грибов, их содержащие (Перечень наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации (Список 1)). Кроме того, в этих грибах может содержаться баеоцистин, который в настоящий момент не отнесен к контролируемым веществам.
Продолжительность действия наркотика равна 4 - 12 ч. Употребляются грибы, как правило, перорально, в свежем или высушенном виде. Дозы псилоцибина и псилоцина, вызывающие галлюцинации, равны примерно 10 мг.
Употребление грибов, содержащих псилоцин и псилоцибин, а также самих алкалоидов в чистом виде изменяет настроение и характер мышления, вызывает возбуждение центральной нервной системы, что приводит к сдвигу сознания и к эйфории. Это состояние выражается в нарушении способности логически рассуждать, возникновении зрительных и звуковых галлюцинаций, а также состояния расслабленности и эйфории. Наблюдаются расширение зрачков и нарушение координации, при передозировке - раздвоение в глазах, тахикардия, гипертензия, повышение температуры, тошнота, рвота.
При употреблении грибов возможны побочные эффекты, основным из которых является так называемый bad trip. Это состояние характеризуется чувством тревоги, доходящей до состояния паники. Другим побочным эффектом является так называемый flashback. Он выражается в неожиданном возникновении повторения галлюцинаций после употребления наркотика, что может вызвать опасность получения травм и смерти при его возникновении в таких ситуациях, как вождение автомобиля, работа на производстве и др.


Структурные формулы и физические свойства псилоцибина, псилоцина и баеоцистина

Псилоцибин (0-фосфорил-4-гидрокси-N, 1 N-диметилтриптамин),
брутто-формула C H N O P; М.м. = 284,25 - белый кристаллический
12 17 2 4
порошок, растворим в разбавленной уксусной кислоте, кипящей
воде в соотношении 1:20, в кипящем метаноле - 1:120, нерастворим
в хлороформе, бензоле. Температура плавления - 220 - 228 °С (из
воды), 185 - 195 °С (из метанола).
Псилоцин (4-гидрокси-N, N-диметилтриптамин), брутто-формула
C H N O; М.м. = 204,27 - белый кристаллический порошок,
12 16 2
растворим в разбавленной уксусной кислоте и этаноле, слабо
растворим в воде. Температура плавления - 173 - 176 °С
(из метанола).
Баеоцистин (0-фосфорил-4-гидрокси-N-метилтриптамин),
брутто-формула C H N O P; М.м. = 270,28 - белый кристаллический
11 15 2 4
порошок. Температура плавления - 254 - 258 °С (из метанола).


ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛОДОВЫХ ТЕЛ ГРИБОВ

При решении вопроса о принадлежности поступившей на исследование массы (вещества) к грибам (плодовым телам грибов) следует изучить особенности строения частиц. Плодовые тела шляпочных грибов отдела Базидиомикота (см. Приложение 4) состоят из шляпки и ножки. На нижней части шляпки расположен гименофор, состоящий из базидии и базидиоспор, образующих спороносный слой. Споры и базидии имеют различную окраску, от которой зависит цвет всего гименофора.
Гименофор может быть различного типа - гладкий, складчатый, шиповатый, трубчатый, пластинчатый. Поскольку для описанных в данной работе псилоцибиносодержащих грибов характерен пластинчатый гименофор, подробно будет описан именно этот тип.
Пластинчатый гименофор представлен радиально расположенными пластинками (пластинки могут быть свободными, не достигающими ножки или достигающими, но не прикрепленными к ней, могут прикрепляться к ножке всем краем или зубцом, а также быть нисходящими (см. приложение 1 - не приводится). Пластинки в сечении имеют вид конуса, с двух сторон которого расположен гимений.
Значительная часть плодового тела (по объему) кроме гимения состоит из плотного переплетения гиф (плектенхимы). Сверху плодовое тело покрыто кожицей, состоящей из гиф с окрашенной оболочкой, что придает характерную окраску шляпке. Формы шляпок представлены в приложении 1.
При исследовании следует учитывать ряд морфологических особенностей плодовых тел грибов. У части агариковых (например, у рода Russula - сыроежек) пластинчатый гименофор закладывается открыто. У других агариковых грибов гименофор сначала прикрыт сплетением гиф - покрывалом. Имеются два типа покрывала: общее и частное. Общее покрывало одевает и шляпку, и ножку целиком, так что в молодом возрасте плодовое тело имеет вид беловатого или сероватого яйца или шара. По мере роста ножка вытягивается, вынося шляпку вверх, а покрывало разрывается и остается у основания ножки в виде влагалища (вольвы) и на поверхности шляпки - в виде хлопьевидных чешуек. Второй тип покрывала - частное - у молодого плодового тела только соединяет края шляпки с ножкой, прикрывая формирующийся гименофор (шампиньоны). При созревании края шляпки развертываются, а покрывало разрывается и остается в виде кольца на ножке, а у ряда видов - как бахрома по краю шляпки. У некоторых видов (например, род паутинник - Cortinarius) покрывало тонкое, паутинистое, и поэтому кольцо быстро исчезает. У мухоморов (род Amanita) плодовые тела имеют одновременно и общее, и частное покрывала (см. приложение 2 - не приводится).
Деление по семействам производят по окраске спор и гименофора, по наличию или отсутствию частного и общего покрывала, по строению и типу расположения пластинок по отношению к ножке.
Форма спор варьирует от правильно-округлой, эллипсоидальной до веретеновидно-вытянутой; встречается угловатая или звездчатая форма. Поверхность может быть гладкая, щетинистая, бородавчатая, бугристая. Окраска спор - от бесцветных (белый споровый порошок) до почти черных. Форма и окраска спор являются наиболее постоянными и устойчивыми диагностическими признаками при дифференциации грибов.
Для исследования спор готовят споровый отпечаток. Для этого шляпки (2 - 3 зрелые, но не старые шляпки) отделяют от ножек и укладывают пластинками вниз на листок белой бумаги. Шляпки накрывают стеклянным или пластиковым колпаком и помещают в прохладном влажном месте. Обычно через день споровый отпечаток бывает готов. Чтобы споры не слетали с бумаги, а также для использования в дальнейшем образца спорового отпечатка, споры закрепляют следующим образом: обратную сторону бумаги смачивают спиртовым раствором канифоли или камеди (при этом спирт улетучивается, а частицы смолы закрепляют споры). Споровый отпечаток лучше всего хранить вместе с образцом.


МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Предварительное исследование плодовых тел грибов. На этой стадии проводят внешний осмотр исследуемых образцов, как невооруженным глазом, так и с помощью средств оптической микроскопии, в ходе которого фиксируются состояние, особенности упаковки и масса объектов, при необходимости выявляют такие признаки исследуемых объектов, как цвет и наличие механических включений и примесей. В случае необходимости производится их механическое разделение для дальнейшего исследования.
В начале исследования необходимо установить общие признаки плодовых тел шляпочных грибов - наличие шляпок (целых или их фрагментов) с пластинчатым гименофором (пластинками) и (или) ножек (целых или их фрагментов). Плодовые тела могут быть представлены как целиком (шляпка и ножка вместе), так и фрагментарно (шляпки и ножки отдельно).


МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Наиболее полно порядок исследования псилоцибиносодержащих грибов разработан экспертами Санкт-Петербурга и Ленинградской области [19 - 20], который был принят за основу в данной работе.


I. Исследование спор

Исследование спор проводят в 3 этапа:
1) От шляпки при помощи пинцета (скальпеля, иглы) отделяют пластинку и помещают ее на предметное стекло (можно использовать споровый порошок из спорового отпечатка). Инструмент тщательно очищают после каждого использования.
2) На предметное стекло наносят каплю 5 - 8% КОН или воды (если исследовали свежее плодовое тело), 5 - 8% КОН (если исследовали высушенные плодовые тела или споровый порошок) и помещают объект исследования; затем накрывают препарат покровным стеклом, излишки жидкости убирают фильтровальной бумагой. Исследование проводят в поле зрения исследовательского микроскопа проходящего света с использованием нейтрального светофильтра при общем увеличении 400 и 600 крат.
3) Изучают форму отдельных спор (лучше всего сделать схематическую зарисовку 1 - 3 спор), определяют размер (длину и ширину) нескольких (5 - 7) спор с помощью окуляр-микрометра, размеры вносят в описание.
В зависимости от состояния плодовых тел грибов исследования проводят двумя путями.


II. Исследование свежих плодовых тел

Работу со свежим материалом необходимо проводить в минимальные сроки, не допуская изменения, разложения, гниения плодовых тел. При необходимости повторного исследования или последующего уточнения ответа эксперта материал хранят в закрытой пластиковой коробке в холодильнике 1 - 2 суток.
Определяют, являются ли поступившие на исследование плодовые тела смесью различных родов (видов) грибов или нет. Для этого сортируют смешанный материал по внешнему виду и раскладывают в отдельные конверты.
Из каждой пробы выбирают (не смешивая их) несколько (если позволял материал, 5 - 7) целых, неповрежденных, имеющих ножки, нормально развитых плодовых тел разного возраста и размера (рис. 1 - не приводится).
На первой стадии делают описание отобранного образца, отмечая следующие особенности:
- размер шляпки (диаметр, высота в мм);
- цвет шляпки (следует учитывать возможность искажения цвета под воздействием внешних условий - излишняя влажность или плодовые тела были подморожены);
- клейкая шляпка или нет;
- характер кожицы на шляпке (сдирается ли, легко ли отходит от шляпки, желатинозность);
- цвет пластинок гименофора шляпки зрелого плодового тела;
- размер ножки (диаметр, длина в мм);
- цвет ножки (необходимо отметить наличие голубого (синеватого) оттенка у основания);
- характер поверхности ножки (гладкая, волокнистая, сухая, влажная, клейкая и т.п.), строение ножки (сплошная, полая), характер мякоти (твердая, хрупкая, водянистая, кожистая, упругая, хрящеватая и т.д.), наличие остатков паутинистого или волокнистого частного покрывала (на молодых экземплярах в верхней части ножки, на расстоянии от шляпки, примерно равном ее радиусу).
Образец сушат целиком в потоке теплого воздуха (40 - 60 °С электросушилкой, лампой накаливания, на батарее отопления и т.п., не допуская как загнивания, так и пересушивания материала).
Высушенный образец хранят в сухом месте с описанием (и споровым отпечатком, если он имелся в наличии) в конверте из листа тонкой, но прочной бумаги. На конверте и на листке с описанием ставят номер образца.


III. Исследование высушенных плодовых тел

При анализе морфологических признаков сухих плодовых тел, поступивших на исследование, учитывают следующее:
- при сушке размер плодовых тел грибов уменьшается, но обычно не более чем в 2 раза, менее всего по основному направлению роста гиф - по длине ножки и по радиусу шляпки;
- цвет высушенных плодовых тел обычно намного светлее свежих. Голубой оттенок, наблюдаемый в основании ножки многих (но не всех) плодовых тел, часто сохраняется и в сухом виде;
- цвет пластинок гименофора при высушивании шляпок плодовых тел мало изменяется; споровый порошок несколько темнеет при высыхании.
Желатинозность шляпки определяют, нанося на ее поверхность 5% раствор КОН (иногда достаточно воды). Если шляпка была клейкой, а кожица желатинозной, эти признаки восстанавливались в месте смачивания.
Дальнейшие исследования проводят аналогично исследованию свежих плодовых тел. Внешний вид высушенных плодовых тел грибов рода Psilocyba приведен на рис. 2 и 3 (не приводятся).
Составленное описание сравнивают с описанием рода и вида грибов, содержащих псилоцибин и псилоцин. В данной работе приведены описания грибов в виде определителя (описания семейства - рода - вида), а также фотографии и иллюстрации. Кроме морфологических признаков трех видов псилоцибиносодержащих грибов, обнаруженных на территории России (Psilocybe semilanceata, Inocybe corydalina и Panaeolus subbalteatus), описаны грибы, наиболее часто выращиваемые на искусственных средах, а также представители родов, наиболее распространенные в естественных условиях произрастания.


ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Перед проведением химического исследования производят отбор представительной пробы исследуемого вещества в соответствии с методикой "Отбор проб при исследовании наркотических средств", утвержденной протоколом Постоянного комитета по контролю наркотиков от 16 ноября 1993 г. N 26. Если поступившие плодовые тела грибов имеют избыточную влажность, отобранные плодовые тела дополнительно высушивают при t = 50 - 60 °C до постоянной массы. Подготовленную пробу измельчают в ступке и гомогенизируют.
Для установления наличия в плодовых телах грибов псилоцибина и псилоцина могут применяться методы качественных цветных реакций, тонкослойной, газовой и жидкостной хроматографии и хроматомасс-спектрометрии по методикам, приведенным ниже.


Исследование методом качественных цветных реакций

Для проведения качественных цветных реакций можно использовать реактивы Эр лиха, Фреде и Марки.
Для этого несколько миллиграммов высушенных измельченных грибов заливают метанолом в соотношении "проба (г) - экстрагент (мл)" 1:10, помещают в ультразвуковую баню на 1 ч либо доводят до начала интенсивного кипения. После отстаивания и охлаждения несколько капель полученного экстракта наносят на предметное стекло или в фарфоровую чашку и упаривают при 50 °С досуха. К полученному сухому остатку прибавляют несколько капель какого-либо из указанных реактивов:
- при прибавлении реактива Эрлиха через 10 - 15 мин. наблюдают серо-фиолетовое окрашивание реактива;
- при прибавлении реактива Марки либо Фреде через 1 - 3 мин. наблюдают серо-коричневое окрашивание реактива.


Исследование методом тонкослойной хроматографии

Полученный ранее экстракт (3 - 10 мкл) наносят на хроматографическую пластину. Хроматографическое разделение проводят один раз в системах растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (2:1:1) или метанол - аммиак (100:1,5). После окончания хроматографирования пластину сушат при комнатной температуре до удаления растворителей, затем выявляют хроматографические зоны по гашению флуоресценции при 254 нм проявлением реактивом Эрлиха, Фреде или Марки.
Для хроматографирования используют пластины с
немодифицированным слоем силикагеля (например, Sorbfil, Merck).
Значение R на пластинах Merck DC-Alufolien Kieselgel 60 F и
f 254
Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ, а также окраска зон после проявления
реактивом Эрлиха и реактивом Марки приведены в табл. 1, 2. Зона
баеоцистина в системе N 1 располагается между зонами псилоцина и
псилоцибина, а в системе N 2 коэффициент хроматографической
подвижности баеоцистина совпадает с коэффициентом псилоцибина.
Окраска зоны баеоцистина совпадает с окраской зоны псилоцибина.


Таблица 1


ЗНАЧЕНИЕ R ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СИСТЕМЕ
f
Н-БУТАНОЛ - УКСУСНАЯ КИСЛОТА - ВОДА В СООТНОШЕНИИ 2:1:1


------------+-------------+---------------------------------------
¦ Компонент ¦ Пластины ¦ Окраска хроматографических зон после ¦
¦ ¦ ¦ обработки проявляющими реактивами ¦
¦ +-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦ ¦Merck¦Sorbfil¦ Эрлиха ¦ Марки ¦ Фреде ¦
¦ +-----+-------+ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ R ¦ R ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ f ¦ f ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦Псилоцин ¦0,75 ¦0,75 ¦Черно- ¦Зелено- ¦Темно- ¦
¦ ¦ ¦ ¦фиолетовая ¦желтая, ¦зеленая, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦темно-серая ¦черно-зеленая¦
+-----------+-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦Псилоцибин ¦0,50 ¦0,46 ¦Фиолетовая ¦Желтая ¦Зеленая, ¦
¦ ¦ ¦ ¦<*> ¦ ¦желто- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦коричневая ¦
------------+-----+-------+-----------+------------+--------------


--------------------------------
<*> Окраска появляется через 10 - 15 мин.


Таблица 2


ЗНАЧЕНИЕ R ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СИСТЕМЕ
F
МЕТАНОЛ - АММИАК В СООТНОШЕНИИ 100:1,5


------------+-------------+---------------------------------------
¦ Компонент ¦ Пластины ¦ Окраска хроматографических зон после ¦
¦ ¦ ¦ обработки проявляющими реактивами ¦
¦ +-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦ ¦Merck¦Sorbfil¦ Эрлиха ¦ Марки ¦ Фреде ¦
¦ +-----+-------+ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ R ¦ R ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ f ¦ f ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦Псилоцин ¦0,33 ¦0,40 ¦Черно- ¦Зелено- ¦Темно- ¦
¦ ¦ ¦ ¦фиолетовая ¦желтая, ¦зеленая, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦темно-серая ¦черно-зеленая¦
+-----------+-----+-------+-----------+------------+-------------+
¦Псилоцибин ¦0,08 ¦0,09 ¦Фиолетовая ¦Желтая ¦Зеленая, ¦
¦ ¦ ¦ ¦<*> ¦ ¦желто- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦коричневая ¦
------------+-----+-------+-----------+------------+--------------


--------------------------------
<*> Окраска появляется через 10 - 15 мин.


В зависимости от условий анализа указанные в табл. 1 и 2

значения R могут незначительно меняться, однако
f
последовательность выхода отдельных компонентов остается такой же.
Кроме того, указанные в таблицах цвета в зависимости от освещения
и чистоты используемых реактивов могут отличаться оттенками.
В случае применения для исследования плодовых тел грибов исключительно метода тонкослойной хроматографии для достоверности необходимо в обязательном порядке подтверждать результаты анализа, полученные в системе N 1, исследованием в системе N 2.


Исследование методом газовой хроматографии

Метод газовой хроматографии применяют для качественного выявления псилоцина и псилоцибина. При исследовании псилоцина и псилоцибина получают их силильные производные с помощью силилирующей смеси - пиридин, триметилхлорсилан, бис-(триметилсилил)-трифторацетамид (BSTFA). Без получения силильных производных псилоцибин разлагается в испарителе хроматографа с образованием псилоцина (масс-спектр псилоцина приведен на рис. 7 - не приводится).
Газохроматографический анализ проводят в следующих условиях:
- колонка кварцевая капиллярная длиной 12 - 30 м и диаметром 0,2 - 0,32 мм с метилсиликоновой стационарной фазой (типа НР-1) либо с метилсиликоновой фазой, содержащей 5% фенильных групп (типа НР-5);
- температура испарителя 250 °С;
- температура детектора 290 °С;
- температура колонки меняется от 100 °С до 280 °С со скоростью 10 - 15 °С/мин.;
- время выдержки при конечной температуре 15 мин.;
- газ-носитель - гелий (азот), детектор пламенно-ионизационный;
- ввод пробы осуществляется с делением потока.
Для проведения исследования несколько миллиграммов высушенных и измельченных грибов заливают метанолом в соотношении "проба (г) - экстрагент (мл)" 1:10, помещают в ультразвуковую баню на 1 ч либо доводят до начала интенсивного кипения. После отстаивания и охлаждения смесь центрифугируют либо фильтруют через ватный фильтр. Фильтрат или осветленный после центрифугирования раствор упаривают досуха и добавляют к нему 0,1 мл пиридина, 0,1 мл триметилхлорсилана и 0,4 мл бис-(триметилсилил)-трифторацетамида (BSTFA) . Полученную смесь нагревают при 100 °С в течение 2 ч в закрытой склянке, а затем хроматографируют в указанных выше условиях.
Индекс удерживания силильного производного псилоцина для колонки НР-1 равен 2098, псилоцибина - 2474.


Исследование методом хроматомасс-спектрометрии

Метод хроматомасс-спектрометрии применяют для установления качественного состава анализируемого объекта. Подготовка пробы аналогична пробоподготовке для газовой хроматографии.
Исследование проводят в следующих условиях:
- ионизация электронным ударом (энергия 70 эВ);
- колонка кварцевая капиллярная длиной 12 - 30 м и диаметром 0,2 - 0,32 мм с метилсиликоновой стационарной фазой (типа НР-1) либо с метилсиликоновой фазой, содержащей 5% фенильных групп (типа НР-5);
- температура испарителя 250 °С;
- температура интерфейса детектора 280 °С;
- температура колонки меняется от 50 °С до 280 °С со скоростью 10 - 15 °С/мин.;
- время выдержки при конечной температуре 10 мин.;
- газ-носитель - гелий;
- ввод пробы осуществляют с делением потока.
Идентификация выявленных компонентов производится по индексам удерживания и масс-спектрам при сопоставлении со спектрами, приведенными ниже.
На рис. 4 - 6 (не приводятся) приведены: типичная хроматограмма силилированного экстракта плодовых тел грибов, масс-спектр псилоцина и масс-спектры силильных производных псилоцина, псилоцибина.


Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют как для качественного выявления псилоцина и псилоцибина в плодовых телах грибов, так и для количественного определения этих алкалоидов (далее - определяемых веществ).
При проведении исследований используют вариант обращенно-
фазной ВЭЖХ, при котором разделение компонентов анализируемых
веществ проводят на колонках, упакованных сорбентами на основе
силикагелей, модифицированных химически привитыми фазами "С "
18
или "ODS". Исследование проводят с использованием
хроматографических систем для ВЭЖХ, оснащенных либо
УФ-детектором с фотодиодной матрицей, либо многоволновым
УФ-спектрофотометром. Ниже рассмотрен пример проведения
исследования с использованием отечественного жидкостного
хроматографа "Милихром-4", оснащенного многоволновым
УФ-спектрофотометром. Однако в общем случае данная методика
рассчитана на возможность применения хроматографических систем,
оснащенных любым из указанных выше детекторов и обеспечивающих
параметры хроматографического разделения компонентов анализируемых
веществ с аналогичными или превосходящими их характеристиками.
При использовании хроматографа "Милихром-4" анализ проводят в следующих условиях:
- колонка 2 x 100 мм, упакованная обращенно-фазным сорбентом "Сепарон SGX С-18" с размером частиц 5 мкм (ООО "Медикант", г. Орел), или колонка аналогичного типа;
- подвижная фаза - фосфатный буфер : ацетонитрил в соотношении 90:10 объемных долей;
- режим элюирования изократический, скорость потока 1